ORYZOX: Valutazione di attività anti-aterogena in vitro

Introduzione

L’aterosclerosi, una malattia cronica delle arterie che si manifesta con ispessimento e indurimento della parete vascolare, è una causa primaria di eventi cardiovascolari gravi come ictus, infarto e occlusione vasale periferica.

La prevenzione dell’aterosclerosi può essere notevolmente influenzata dalla gestione dei livelli di colesterolo, in particolare tramite l’adozione di una dieta ricca di nutraceutici con proprietà antinfiammatorie vascolari. Il colesterolo LDL, spesso descritto come “cattivo” colesterolo, tende ad accumularsi sulle pareti dei vasi sanguigni, formando placche che restringono e induriscono le arterie. Questo approccio alimentare, mirato a mantenere bassi i livelli di colesterolo e a prevenire l’adesione del colesterolo alle pareti arteriose, rappresenta una strategia chiave nella prevenzione dell’aterosclerosi e delle relative complicanze cardiovascolari.

In questo contesto, sostanze come il gamma-orizanolo si presentano come potenziali agenti terapeutici nel controllo dell’infiammazione vascolare legata all’aterosclerosi.
L’infiammazione svolge un ruolo cruciale nell’aterosclerosi, caratterizzata da uno stato infiammatorio persistente e di basso grado nelle arterie. Cellule immunitarie come macrofagi, linfociti e mastociti sono attivamente coinvolte nella formazione delle placche aterosclerotiche, creando un circolo vizioso con l’accumulo di grassi e l’infiammazione [1].

Le fasi iniziali dell’aterosclerosi vedono sia il deposito che la modifica chimica dei grassi, che attraverso processi di ossidazione attivano le cellule immunitarie e promuovono il rilascio di mediatori pro-infiammatori [2]. Questa infiammazione cronica è un’alterazione dell’equilibrio tra mediatori pro e anti-infiammatori, portando a una risoluzione inefficace del processo infiammatorio [3].
Un aspetto importante nell’aterosclerosi è la disfunzione delle cellule endoteliali. Queste, in risposta a stress fisici o chimici, subiscono un’alterazione del loro fenotipo funzionale, esprimendo molecole infiammatorie e favorendo il reclutamento di cellule immunitarie [4].

Le molecole di adesione cellulare, come ICAM-1 e VCAM-1, giocano un ruolo significativo nella modulazione delle interazioni infiammatorie e potrebbero rappresentare target terapeutici interessanti [5].
Le strategie anti-infiammatorie hanno mostrato efficacia nel ridurre gli eventi cardiovascolari e la mortalità, sottolineando la necessità di gestire i fattori di rischio e sviluppare nuovi approcci terapeutici [6,7]. L’importanza dell’infiammazione nell’aterosclerosi è ulteriormente rafforzata dai successi nel trattamento della malattia attraverso la modulazione delle risposte immunitarie, sia innate che adattive [8].

L’immunomodulazione, così come l’assunzione di una dieta attenta e di un’integrazione alimentare mirata, sono tra gli approcci più promettenti in questo ambito [9].
In tale panorama, il gamma-orizanolo si profila come una sostanza promettente per le sue potenzialità anti-aterosclerotiche, agendo sui meccanismi di infiammazione vascolare, e rappresenta un importante argomento di indagine per il trattamento e la prevenzione delle malattie cardiovascolari.

I test di attività antinfiammatoria pro-aterogena in vitro sono stato eseguiti su cellule endoteliali della linea HUVEC (ATCC), attivate in senso infiammatorio mediante la stimolazione con IL1-B o con TNF-A e trattate con concentrazioni crescenti di Gamma-Oryzanol “Oryzox” (i.e. 31.25, 62.5, 125 ug/ml). Per la stima dell’effetto di Gamma-ORY sulla regolazione dell’infiammazione è stata quantificata l’espressione di membrana delle proteine ICAM-1 e VCAM-1 in citofluorimetria a flusso (FACS), mediante marcatura rispettivamente con gli anticorpi anti-ICAM-1 Alexa-633 e anti-VCAM-1 Alexa-488. La solubilità del campione in analisi è stata valutata in diversi solventi ed una volta appurata la condizione migliore, saggi di tossicità cellulare sono stati effettuati ai tempi di 24, 48 e 72h ed alle concentrazioni sopradette.

A nessuna delle condizioni analizzate è corrisposta una citotossicità né del preparato in soluzione, né del veicolo utilizzato. Si è quindi optato per la tempistica di 72h come quella a cui trattare le colture cellulari con Gamma-ORY. Dato che gli esiti delle prove al FACS propedeutiche la sperimentazione hanno mostrato una minore espressione di ICAM-1 e VCAM-1 con l’induzione di IL1-B rispetto a quella con TNF-A (24h entrambi gli stimoli), si è preferito utilizzare quest’ultimo alla concentrazione di 10ng/ml per la stimolazione del modello infiammatorio in vitro (Fig.1). I risultati finali della sperimentazione sono riportati in Fig.2 in cui sono mostrati i dati dell’effetto del trattamento con Gamma-ORY in termini di percentuale rapportata al controllo positivo (i.e. cellule solo attivate con TNF-A, 100% attivazione).

Fig.1. Esito della stimolazione con IL1-B e TNF-A sull’espressione di VCAM-1 e ICAM-1. Le cellule HUVEC sono state attivate con i due stimoli pro-infiammatori alle concentrazioni indicate in legenda per 24h (CTR, non trattato). I valori di espressione raggiungono la significatività statistica essenzialmente in seguito alla stimolazione con TNF- A alle concentrazioni di 5 e 10 ng/ml.

Fig.2. Effetto del trattamento con Gamma-Oryzanol sull’espressione di VCAM-1 e ICAM-1. Le cellule attivate con TNF-A (10 ng/ml, 24h) sono state incubate per 72h con Gamma-ORY (dosi in legenda) o no (CTR TNF-A). La stima dell’effetto del trattamento è riportata come percentuale di VCAM-1 e ICAM-1 espresse nelle condizioni trattate con Gamma-ORY rispetto a quella non trattata (100%, controllo TNF-A attivato). (*) Significatività statistica espressione VCAM-1 trattato con Gamma-ORY 125 ug/ml vs CTR non trattato con la sostanza (p=0.05).

Le molteplici analisi sono state eseguite per individuare livelli apprezzabili e attendibili dei marcatori di adesione, tali che fossero rappresentativi in modo ottimale di infiammazione endoteliale. Dal set sperimentale rivolto alla quantificazione delle molecole di membrana VCAM-1 e ICAM-1, risulta che il trattamento con Gamma-ORY è efficace nel modularne l’espressione ed in particolare nel ridurne i livelli, diminuendo di conseguenza il grado di attivazione cellulare in senso pro-aterogeno. In particolare, l’espressione di VCAM-1 trattato con Gamma-ORY alla dose di 125 g/ml ha mostrato una diminuzione statisticamente significativa rispetto al controllo non trattato con la sostanza (Fig.2.). I valori mostrati in Tabella 1 indicano di quanto viene inibita in percentuale, l’espressione di ognuna delle molecole di adesione in seguito al trattamento con dosi crescenti di Gamma-ORY rispetto all’assenza di trattamento. L’assenza di trattamento è la condizione rappresentata dal controllo positivo, costituito da cellule attivate solamente con TNF-A e non trattate con Gamma-ORY (i.e. CTR TNF-A, ovvero 100% espressione di VCAM-1 e ICAM-1, ovvero 100% di attivazione infiammatoria pro-aterogena).

Tab.1. Effetto del trattamento con Gamma-Oryzanol sull’espressione di VCAM-1 e ICAM-1.

Valori della percentuale di riduzione dell’espressione delle due proteine dovuta all’effetto della dose applicata, rispetto all’infiammazione non trattata.

1. Libby P, Buring JE, Badimon L, Hansson GK, Deanfield J, Bittencourt MS, Tokgözo?lu L, Lewis EF. “Atherosclerosis.” Nat Rev Dis Primers. 2019 Aug 16;5(1):56.
2. Gisterå A, Hansson GK. “The immunology of atherosclerosis.” Nat Rev Nephrol. 2017 Jun;13(6):368-380.
3. Zhu Y, Xian X, Wang Z, Bi Y, Chen Q, Han X, Tang D, Chen R. “Research Progress on the Relationship between Atherosclerosis and Inflammation.” Biomolecules. 2018 Aug 23;8(3):80.
4. Gimbrone Jr MA, García-Cardeña G. “Endothelial Cell Dysfunction and the Pathobiology of Atherosclerosis.” Circ Res. 2016 Feb 19;118(4):620-36.
5. Price DT, Loscalzo J. “Cellular adhesion molecules and atherogenesis.” Am J Med. 1999 Jul;107(1):85-97.
6. Bugger H, Zirlik A. “Anti-inflammatory Strategies in Atherosclerosis.” Hamostaseologie. 2021 Dec;41(6):433-442.
7. Chistiakov DA, Melnichenko AA, Grechko AV, Myasoedova VA, Orekhov AN. Potential of anti-inflammatory agents for treatment of atherosclerosis. Exp Mol Pathol. 2018. Apr;104(2):114-124.
8. Deroissart J, Porsch F, Koller T, Binder CJ. “Anti-inflammatory and Immunomodulatory Therapies in Atherosclerosis.” Handb Exp Pharmacol. 2022:270:359-404.
9. Yamashita T, Sasaki N, Kasahara K, Hirata K-I. “Anti-inflammatory and immune-modulatory therapies for preventing atherosclerotic cardiovascular disease.” J Cardiol. 2015 Jul;66(1):1-8.
10. Centro di Medicina Biologica srl https://www.centrodimedicinabiologica.it/aterosclerosi-e-infiammazione-vascolare/